摘要：通過研究雞源性乳酸菌表面自凝集和與大腸桿菌互凝集的特性，探討其對雞腸道環境生長的適應性。按照常規方法分離鑒定雞源性乳酸菌，并通過凝集試驗檢測自凝及其與致病菌大腸桿菌的互凝特性。結果顯示從肉雞中分離篩選出3株雞源性益生菌；初期3菌株之間的自凝能力隨培養時間的增長而凝集能力增強，其互凝率也隨時間的增長而增強，并且自凝率高的菌株，對應的互凝率偏高。這表明體外培養時間可能影響雞源性乳酸菌自凝及其與致病性大腸桿菌相互凝集性能。
關鍵詞：雞源性益生菌；分離鑒定；凝集特性
益生菌是由一種或幾種有益的微生物及其代謝產物組成的可供人或動物直接使用的活菌制劑，又稱活菌劑、微生態制劑、促生素、生菌素等[1]。但由于在加工、保存、運輸和使用過程中活菌制劑易失活，且機體內部酸堿環境對其有發生作用，致其不能充分發揮作用。故篩選益生菌菌株時最好來自同源動物。益生菌在腸道內黏附性能是判斷其能否發揮功效的一項重要指標。黏附性能既是益生菌在腸道內定植的先決條件，又是益生菌發揮其對宿主有益的生理、生化作用的基礎[2]。大量研究結果表明，菌體的黏附能力與其表面凝集能力呈正相關[3—4]。此外對致病菌的凝集作用也是腸道益生菌的一個重要特征。本文從健康肉雞腸道中分離、篩選、純化雞源性乳酸菌，并對其進行生化鑒定、自凝集能力和對致病菌大腸桿菌互凝集能力進行了研究，現報道如下。
1 材料與方法
1.1試驗材料
1.1.1試驗動物
選用健康成年肉雞。
1.1.2試劑
MRS培養基：蛋白胨10g/L,牛肉浸粉5g/L,酵母浸粉4g/L，葡萄糖20g/L，磷酸氫二鉀2g/L，檸檬酸三銨2g/L,醋酸鈉5g/L,硫酸鎂0.2g/L,硫酸錳0.05g/L,瓊脂15g/L,吐溫80 1g/L
MRS液體培養基：蛋白胨10g/L,葡萄糖20g/L,酵母粉4g/L,牛肉粉5g/L,硫酸錳0.05g/L,硫酸鎂0.2g/L,磷酸氫二鉀2g/L,乙酸鈉5g/L,吐溫80 1g/L,檸檬酸三銨2g/L。
碳酸鈣、革蘭氏染液、PBS緩沖液、生化發酵管均從市場購買
1.1.3致病菌
1株致病性大腸桿菌O78，由河北工程大學課題組提供。
1.1.4主要儀器
顯微鏡，培養箱、紫外可見分光光度計，高速離心機
1.2方法
1.2.1菌種的分離
從健康雞盲腸中刮取黏膜和內容物各1g，置于盛有9ml無菌生理鹽水中，充分震蕩搖勻，然后吸取0.5ml菌液置于4.5ml無菌生理鹽水的試管中，此稀釋度為10-1。重復以上過程，依次制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的菌液，選擇10-5、10-6、10-7三個梯度的菌液吸取0.lml菌液分別滴于MRS培養基平板上，37℃培養24一48h挑取形態不同的菌落鏡檢，分別在其選擇培養基上劃線接種做純培養，而后置于4℃冰箱保存備用。
1.2.2菌種形態觀察
采用革蘭氏染色法染色，然后鏡檢。
1.2.3生化試驗
革蘭氏陽性兼性厭氧無芽孢桿菌的試驗項目包括：過氧化酶試驗、硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗、硫化氫試驗、糖發酵試驗，37℃培養24h。試驗結果與《伯杰氏細菌鑒定手冊》對照進行綜合判定，如均為陰性，則可初步定為乳酸桿菌屬。
革蘭氏陽性兼性厭氧球菌的試驗項目包括：細胞形態學檢查，葡萄糖產酸產氣試驗、10℃, 45℃，60℃ 30min生長試驗，pH9.2 和 pH9.6生長試驗，4%NaCl,，6.5%NaCl生長試驗，根據上述試驗結果進行初步鑒別。
在各類初步鑒定后，進行生化發酵管進行屬種的鑒定，生化管種類有：乳糖、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、葡萄糖酸鹽、纖維二糖、七葉苷、果糖、阿拉伯糖、甘露糖、密二糖、松三糖、精氨酸脫羧酶，結果與《常見細菌系統鑒定手冊》和《乳酸細菌的分類鑒定與實驗方法》對照，進行鑒定。
1.2.4凝集試驗方法
參照文獻[5]的方法做凝集試驗。
1.2.4.1菌體的處理
在無菌條件下操作，將菌種接種至MRS液體培養基中，接種量為1%，30℃有氧條件培養24h，菌液通過4000 r/min 離心15min收集菌體，菌體用pH=7.2的PBS清洗2次，然后重懸于PBS，用紫外分光光度計調整菌懸液在波長600nm處的吸光度A600在0.25±0.05范圍內。致病菌菌體處理方法采用同樣方法。
1.2.4.2菌體自凝集
吸取4 ml已調整吸光度的菌懸液加入至無菌試管中，靜置于室溫下，分別在0、2、4、6、8、10、20、24、36、48h時測定該菌懸液在波長600nm處的吸光值。自凝集率（A%）計算公式：A%=（A0-At）/A0×100。式中A0為0h的吸光光度值，At為不同時間點的吸光光度值。
1.2.4.3菌體對致病菌的凝集
吸取2 ml菌種菌懸液和2 ml致病菌菌懸液于無菌試管中，混勻，室溫下靜置，分別在0、2、4、6、8、10、20、24、36、48h時測定其在波長為600nm處的吸光值。對致病菌的凝集率（A%）計算公式：A%=（1-Amix/A0）×100 計算。公式中Amix為致病菌與待測乳酸菌混合液在不同時間點的吸光值，A0為0h混合液的吸光值。
2、結果
2.1菌種的鑒定結果
2.1.1菌落特征及細菌形態特征
從加有碳酸鈣的MRS培養基中選擇產生溶鈣圈的不同形態的菌落，最終從分離篩選出的7株菌中篩選得到以下3株菌，編號為B2、C2和L1，其菌落形態和鏡檢結果見表1。由表2、3可見，B2和L1為球菌；C2為桿菌。
表1益生菌的形態學結果
|
菌株 |
菌落形態 |
革蘭氏染色 |
菌體形態 |
|
B2 |
乳白色菌落，圓形隆起，邊緣
整齊，有溶鈣圈 |
陽性 |
球菌，成對、成鏈排列，無芽孢 |
|
C2 |
白色半透明小菌落，圓形隆起，邊
緣整齊，有溶鈣圈 |
陽性 |
桿菌，兩端鈍圓，成對或成鏈狀排列，無芽孢 |
|
L1 |
乳白色菌落，圓形隆起，邊緣
整齊，有溶鈣圈 |
陽性 |
球菌，成對、成鏈排列，無芽孢 |
2.1.2菌屬的鑒定結果
由表2可見，C2為桿菌，過氧化酶試驗、硝酸鹽還原試驗、吲哚試驗、硫化氫試驗均為陰性，明膠不液化，葡萄糖產酸不產氣，因此這株菌鑒定為乳酸桿菌屬的細菌。
表2 乳酸桿菌屬的鑒定結果表
|
菌種 |
過氧化酶 |
硝酸鹽還原 |
產生硫化氫 |
產生吲哚 |
明膠液化 |
葡萄糖 |
|
C2 |
- |
- |
- |
- |
- |
+ |
注：表中“+”表示90%以上菌株陽性，“一”表示90%以上陰性，“○”表示90%以上產氣。
由表3可見，B2和L1經過硝酸鹽還原試驗檢驗均為陰性,且發酵葡萄糖產酸不產氣,通常在10℃和45℃能生長， PH9.2和4%NaCl也可生長，可以初步鑒定為腸球菌屬的細菌。
表3 腸球菌屬的鑒定結果表
|
菌種 |
葡萄糖產酸產氣 |
硝酸鹽還原 |
10℃生長 |
45℃生長 |
PH9.2生長 |
4%NaCl生長 |
|
B2 |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
L1 |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
注：表中“+”表示90%以上菌株陽性，“一”表示90%以上陰性，“○”表示90%以上產氣。
2.1.3乳酸菌種的鑒定
通過與《常見細菌系統鑒定手冊》、《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》對照結果，鑒定表4中C2為短乳桿菌。
表4 C2乳酸桿菌屬種的鑒定結果表
|
微量發酵管種類 |
乳糖 |
蔗糖 |
麥芽糖 |
葡萄糖 |
葡萄糖酸鹽 |
纖維二塘 |
七葉苷 |
果糖 |
阿拉伯糖 |
甘露糖 |
密二糖 |
松三糖 |
15
℃
生
長 |
精氨酸脫羧酶 |
|
結果 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
- |
+ |
+ |
注：表中“+”表示90%以上菌株陽性，“一”表示90%以上陰性。
通過與《常見細菌系統鑒定手冊》、《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》對照結果，鑒定表5中B2為糞腸球菌，L1為盲腸腸球菌。
表5 腸球菌屬種的鑒定結果表
|
|
乳糖 |
蔗糖 |
麥芽糖 |
葡萄糖 |
甘油 |
山梨醇 |
果糖 |
阿拉伯糖 |
甘露糖 |
密二糖 |
松三糖 |
0.1%美蘭牛乳 |
6.5%
NaCl |
|
B2 |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
- |
+ |
|
L1 |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
注：表中“+”表示90%以上菌株陽性，“一”表示90%以上陰性。
2.2凝集試驗的結果
2.2.1自凝集結果
菌株一般都有自凝現象，菌株的自凝集是指同一種菌株之間相互凝集形成多細胞簇現象。自凝集能力在益生菌中具有很重要的意義，益生菌菌株通過自凝集作用相互凝集到一定的數量進而達到菌株發揮益生功效所需的量，另一方面自凝集的作用使益生菌形成阻礙致病菌在腸道定植的屏障[2]。同時，菌體的黏附能力與其表面凝集能力也呈正相關關系。但與他人報道乳酸菌自凝變化有一定差異。
3株菌的自凝集結果見表6，由圖表所示菌株在0-2h內自凝能力最快，當到達20h后，自凝率開始下降，甚至L1出現停滯自凝的現象。總體看，3株菌都有自凝的表現，其中C2的自凝能力更強，L1生物自凝能力最弱。
2.2.2對大腸桿菌的互凝結果
不同菌株之間產生的凝集作用稱為互凝集作用。菌株和致病菌相互凝集的能力與抑菌能力的大小有著一定的關系。由表7可見，這3株菌對致病性大腸桿菌具有一定的凝集作用。其中C2菌株相對于其他兩株菌的凝集能力要強，L1菌株則表現的相對弱一些。這與自凝能力的表現是一致的，由此可以反映出，自凝能力強的其互凝能力也很強。
3、討論
近年來，隨著微生態學的研究,人們漸漸認識到益生菌在防治某些動物疾病和促進動物生長發育方面的優越性，同時化學藥品、抗生素引起的耐藥菌株和畜禽產品中的殘留及二重感染等問題也受到國際社會的普遍關注與擔憂，益生菌在動物養殖業的應用開發研究范圍越來越廣泛[6-7]。
腸道菌群通過細菌黏附作用來實現定植，進入腸道后能否黏附在宿主腸道黏膜上皮細胞表面，形成穩定優勢菌群，是保證益生菌應用效果的重要條件[8]。許多資料已經表明乳酸菌的凝集作用可促進阻止致病菌定植和感染的屏障形成[9-11] 。本試驗從雞腸道內分離出了糞腸球菌、盲腸腸球菌和短乳桿菌3株乳酸菌，發現不同種類雞源性乳酸菌在體外培養過程中，其自凝及其與致病性大腸桿菌相互凝集性能有差異。故認為篩選益生菌菌種時，應為提高其在機體內發揮作用，應考慮其自凝及互凝性能。
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